Вирус гепатита в количественный днк

Вирус гепатита в количественный днк

In-house quantitative real-time PCR for the diagnosis of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5052370/

Количественная оценка вирусных нуклеиновых кислот в сыворотке в ПЦР в реальном времени играет важную роль в диагностике вируса гепатита В и инфекции вируса гепатита С. В этом исследовании мы разработали анализ с использованием конкретных праймеров и зондов для количественной оценки ДНК вируса гепатита B или РНК вируса гепатита С в сыворотке от инфицированных пациентов. Для стандартизации и проверки анализа использовалась международная группа вирусов вируса гепатита В / гепатита С и стандартных плазмид. Коэффициент корреляции 0,983 и 0,963 для вируса гепатита В и вируса гепатита С, соответственно, был получен на основе пороговых значений цикла и концентраций ДНК или РНК. Стандартная кривая показала линейную зависимость от 19 МЕ / мл до 1,9 × 109 МЕ / мл сыворотки с коэффициентом определения (r2) 0,99. В сыворотке пациентов, инфицированных вирусными нагрузками вируса гепатита В или вируса гепатита С (19 МЕ / мл и 1,9 × 109 МЕ / мл), мы количественно определяли вирусные нагрузки с пределом обнаружения 1,9 × 102 МЕ / мл. В настоящее время количественный анализ ПЦР, разработанный в этом исследовании, является идеальной системой для рутинной диагностики и подтверждения неопределенных серологических результатов, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом.

Острые и хронические инфекции с вирусом гепатита B (HBV) или вирусом гепатита C (HCV) приводят к значительной смертности и являются серьезной проблемой общественного здравоохранения во всем мире. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), 130-150 миллионов человек инфицированы HCV во всем мире, а 240 миллионов человек хронически инфицированы HBV. По оценкам, у 30% инфицированных развивается цирроз печени и / или гепатоцеллюлярная карцинома (HCC) .1, 2, 3

HBV и HCV-инфекцию обычно диагностируют путем обнаружения антител против HBV / или анти-HCV в сыворотке пациента, которые реагируют на рекомбинантные белки HBV или HCV в иммуноферментном анализе или иммуноферментном анализе. Однако эти маркеры имеют ограничения, которые снижают точность диагностики. Чтобы преодолеть эти проблемы, в последние несколько лет было разработано несколько анализов для обнаружения нуклеиновых кислот вирусов, вызывающих гепатит. 4, 5, 6, 7, 8

Определение уровня РНК ДНК HBV или HCV в сыворотке стало важным инструментом для идентификации людей с высокими вирусными нагрузками, которые могут указывать на высокую инфекционность, для мониторинга прогрессирования заболевания и эффективности противовирусных терапий, для выявления резистентных к лекарственным средствам мутантов и для выявления рецидива после прекращение антивирусной терапии.9, 10, 11, 12 Ограничение в исследованиях вируса гепатита — отсутствие чувствительного и высокоспецифического теста для измерения вирусных нагрузок в плазме или сыворотке. В предыдущих исследованиях использовались подходы, основанные на ПЦР в режиме реального времени, для определения вирусных нагрузок у инфицированных пациентов. С высокой чувствительностью и специфичностью, широкой способностью обнаружения, простотой и воспроизводимостью этот метод особенно полезен для анализа большого количества образцов и для измерения вирусной нагрузки.13, 14, 15, 16. В настоящем исследовании мы разработали чувствительный метод для количественной оценки ДНК HBV и РНК HCV в сыворотке от инфицированных пациентов с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qPCR) с использованием специфических праймеров и технологии флуоресцентного зонда с привязкой к второстепенным канавкам TaqMan.

Всего у пациентов, инфицированных HBV или HCV, было получено 116 образцов сыворотки. Это исследование было одобрено Комитетом по этике Университета Федерал де Juiz de Fora (протокол 042/2010).

Последовательности праймера и зондов, используемые в этом исследовании, перечислены в таблице 1. Праймеры были выбраны из опубликованной литературы, а зонды были разработаны с использованием Primer Express Software (Applied Biosystems, Foster, CA, USA). Программы, в том числе AmplifX (CNRS, Aix-Marseille Université, http://crn2m.univ-mrs.fr/pub/amplifx-dist), были использованы для прогнозирования поведения этих праймеров. Ожидаемая гибридизация и специфичность наборов праймеров-зондов, нацеленных на ДНК HBV и РНК HCV, определяли в силиконовом анализе с использованием программы BLAST (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Репортер-краситель FAM прикрепляли к 5′-концам зондов, а к 3′-концам прикрепляли нефлуоресцентный тушитель (NFQ) и небольшое связующее канавку (MGB). Все праймеры и зонды были синтезированы Integrated DNA Technologies.

Нуклеиновые кислоты экстрагировали из 200 мкл сыворотки с использованием набора QIAamp MinElute Virus Spin (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США) в соответствии с предлагаемым протоколом производителя. Концентрацию и качество экстрагированной ДНК и РНК оценивали с помощью спектрофотометрии Nanovue (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и амплификацией фрагмента гена, кодирующего β-актин (внутренний контроль) (GenBank No. AY5827991) , Экстрагированную ДНК и РНК хранили при -80 ° С до использования.

Вирусовую РНК подвергали обратной транскрипции с использованием случайных праймеров и набора обратной транскрипции большой кДНК (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) в соответствии с предлагаемым протоколом производителя. Полученную кДНК хранили при температуре -20 ° С до использования.

Для оценки размеров амплифицированных продуктов использовали обычную ПЦР. Условия амплификации следующие: 10 мкл реакционной смеси, содержащей 50-100 нг / л матричной ДНК, 0,1 мкмоль / л смеси праймера, 1 мкмоль / л дезоксинуклеозидтрифосфатов, 1 мкл 10 × буфера, 2 ммоль / л MgCl2, и 0,05 мкл полимеразы Gold Star Taq с условиями циклирования, которые включали стадию начальной денатурации и стадии полимеразы в течение 10 мин при 95 ° С, затем 35 циклов денатурации при 95 ° С в течение 1 мин, отжиг праймера при 60 ° С для 1 мин, удлинение при 72 ° С в течение 2 мин, а затем конечную стадию удлинения 10 мин при 72 ° С. Все продукты ПЦР были визуализированы после 6% полиакриламидного гель-электрофореза и окрашивания гелей нитратом серебра, как описано в [ 19.

Анализ qPCR был оптимизирован в соответствии с рекомендациями MIQE. 20 Эксперименты с грунтовым и зондирующим матрицами проводились путем выбора для каждого гена концентрации праймера, которая приводила к наименьшему пороговому циклу (Ct) и наивысшему ΔRn с использованием фиксированного количества целевой матрицы. Реакции с разной концентрацией праймеров и зондов проводили в общих объемах 25 мкл и 12,5 мкл буфера TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems, Foster CA, США); смысловой праймер и концентрации антисмысловых праймеров 50 нМ, 300 нМ и 900 нМ каждый; зонды при концентрациях 80 нМ, 125 нМ, 150 нМ и 250 нМ; и 1 мкл ДНК или кДНК. Реакцию проводили с использованием системы PCR 7500 Real-Time (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) с использованием универсальных условий: 50 ° C в течение 2 мин, 95 ° C в течение 10 минут, 45 циклов 95 ° C в течение 15 с , и 60 ° С в течение 1 мин. Для этих реакций была использована группа количественного определения OptiQuant HBV / HCV (AcroMetrix, Benicia, CA, USA) в следующих концентрациях, выраженных в международных единицах / мл (МЕ / мл): HBV 7 или HCV 7 (5 000 000 МЕ / мл) и HBV 2 или HCV 2 (50 МЕ / мл).

Для подтверждения анализа международная комиссия, указанная выше, использовалась в реакциях qPCR для построения стандартных кривых ДНК HBV или РНК HCV в следующих концентрациях: HBV 7 или HCV 7 (5 000 000 МЕ / мл), HCV 6 или HBV 6 (500 000 IU / mL), HBV 5 или HCV 5 (50 000 МЕ / мл), HBV 4 или HCV 4 (5000 МЕ / мл), HBV 3 или HCV 3 (500 МЕ / мл) и HBV 2 или HCV 2 (50 IU / мл). Реакции проводили в 7500 PCR-системе реального времени (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) с использованием системы обнаружения TaqMan (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) с 12,5 мкл универсального основного буфера TaqMan, заданных концентраций упомянутых выше наборов праймеров-зондов и 50-100ng ДНК или кДНК для общего конечного объема 25 мкл на реакцию. Все реакции проводили в двух повторностях с использованием универсальных условий: 50 ° С в течение 2 мин, 95 ° С в течение 10 мин, 45 циклов 95 ° С в течение 15 с и 60 ° С в течение 1 мин. Результаты анализировали с использованием 7500 Fast Software v. 2.1 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) и выражали в МЕ / мл. Базовые и пороговые значения автоматически корректировались для каждого теста.

Для количественной оценки вирусных нагрузок стандартные кривые были построены из серии разбавлений клонированных плазмид, содержащих вставки в консервативной области каждого вируса в начальных концентрациях 5,1 × 109 МЕ / мл и 4,9 × 109 МЕ / мл для HBV и HCV, соответственно, в общей сложности восемь точек в каждой кривой. Фрагменты амплифицировали с помощью обычной ПЦР и клонировали с использованием набора клонирования TOPO TA (Invitrogen, California, CA, США) в соответствии с инструкциями производителя. Клонирование и трансформации выполняли, используя набор ClonJET PCR Cloning Kit и TransformAid Bacterial Transformation Kit, соответственно (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) в соответствии с протоколом производителя. Концентрацию рекомбинантных плазмид определяли с использованием флюорометра Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), и реакции проводили в 7500 PCR-системе реального времени (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) с использованием TaqMan (Life Technologies, Carlsbad, CA, США). Анализы состояли из 12,5 мкл универсального основного буфера TaqMan, заданных концентраций праймеров и зондов и 50-100 нг ДНК или кДНК для конечного объема 25 мкл на реакцию. Все реакции проводили в двух экземплярах. Результаты анализировали с использованием 7500 Fast Software v. 2.1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) и выражали в IU / мл целевой матрицы. Базовые и пороговые значения автоматически корректировались для каждого теста. Относительную эффективность амплификации оценивали по наклону линейной регрессии значений Ct против концентраций ДНК или кДНК. Эффективность реакции определяли по следующей формуле 20: E = 10-1slope-1 × 100.

Чтобы проверить этот анализ, образцы сыворотки были собраны у пациентов, инфицированных, остро или хронически, с HBV или HCV и поддерживались при -20 ° C до использования. Критерием включения было наличие инфекции HBV или HCV. Критерием исключения было отсутствие инфекции HBV или HCV. Этот набор из 49 HBV и 67 HCV положительных сывороток был использован для проверки анализа qPCR. Для реакций qPCR в качестве стандартной кривой использовали серию разбавления стандартной плазмиды.

LOD анализа определяли путем серийного разбавления стандартной плазмиды (1,9 × 1010-0,19 × 100 МЕ / мл) и определения самой низкой концентрации каждого клона, обеспечивающей скорость обнаружения 90% или выше.

Размеры продуктов, усиленных обычной ПЦР, представлены на рисунке 1. Продукты имели ожидаемый размер, что указывает на усиление шаблона-мишени.

Чтобы стандартизировать анализ qPCR для количественной оценки HBV или HCV, для определения оптимальных условий обнаружения использовались различные концентрации праймеров и зондов. Таблица 2 показывает значения Ct и наклон линейной регрессии от реакций при этих концентрациях. Используя элементы управления HBV 7 или HCV 7 в качестве шаблонов, амплификация была обнаружена во всех комбинациях наборов праймеров. Для контролей HBV 2 или HCV 2 амплификация была обнаружена только при концентрациях прямого и обратного праймеров 50 нМ и 300 нМ соответственно. Мы не обнаружили различий в характеристиках анализа при различных концентрациях зонда, и конечная концентрация зонда 125 нМ была использована во всех реакциях qPCR.

Для проверки анализа количественного определения HBV и HCV стандартная кривая была построена с использованием ДНК HBV или РНК HCV с международной группы. Графики амплификации и стандартные кривые обоих вирусов показаны на рисунке 2. Регрессии значений Ct и концентраций ДНК HBV или кДНК HCV показали коэффициенты корреляции 0,983 и 0,963 для HBV и HCV, соответственно. Склоны стандартных кривых для HBV и HCV составляли -3,438 и -2,898 соответственно.

Чтобы получить стандартную кривую для абсолютного количественного определения ДНК HBV и РНК HCV, в качестве шаблонов использовались 10-кратные разведения стандартных плазмид. График амплификации и стандартная кривая (фиг.3), которые были получены, показали линейную зависимость от 5,1 × 102 до 5,1 × 109 МЕ / мл и от 4,9 × 102 до 4,9 × 109 МЕ / мл для HBV и HCV соответственно. Значения наклона составляли -3,583 и -3,263 для HBV и HCV, соответственно. Линейный регрессионный анализ дал коэффициент определения (r2) 0,99 и эффективность 90-100% для HBV и HCV.

В общей сложности 49 образцов сыворотки от пациентов, инфицированных HBV и 67 образцов сыворотки пациентов, инфицированных HCV, были проанализированы с помощью qPCR. Во всех клинических образцах можно было количественно оценить вирусную нагрузку и оптимизировать анализ для приемлемой чувствительности.

Для определения LOD анализа использовали серию разбавления стандартных плазмид для каждого вируса в диапазоне от 1,9 × 1010 до 0,19 × 100 МЕ / мл. Было обнаружено, что 90% LOD для анализа составляет 1,9 × 102 МЕ / мл для каждого вируса.

В этом исследовании мы разработали собственный анализ на основе qPCR для количественной оценки ДНК HBV и РНК HCV в сыворотке от инфицированных пациентов. Анализ, предложенный для использования в диагностике HBV и HCV, амплифицировал консервативные области геномов HBV и HCV и был стандартизирован и подтвержден с использованием различных концентраций наборов праймер-зондов и международных стандартов нуклеиновой кислоты. Вирусовую ДНК или РНК, выделенную обычно используемым набором экстракции нуклеиновой кислоты, можно использовать для количественного определения вируса в исходном объеме образца всего 200 мкл.

Праймеры, используемые для обнаружения HBV, специфичны для высококонсервативной области S-гена.17 Все генотипы HBV, обнаруженные у бразильских пациентов и описанные в предыдущих исследованиях, были обнаружены с использованием тех же праймеров, которые использовались в этом исследовании.17, 21 Праймеры, выбранные для HCV нацеливают сохраненную 5′-непереводимую область вирусной РНК. Согласно литературе, все генотипы HCV могут быть обнаружены с помощью этих праймеров.18 Более того, 5′-нуклеазный флуорогенный зонд, используемый в этом исследовании, обладает большей специфичностью и чувствительностью и более широким динамическим диапазоном обнаружения, чем анализы, которые используют ДНК-связывающие красители. Следовательно, анализ должен позволять точную количественную оценку всех генотипов HBV и HCV.

В этом исследовании анализ qPCR обнаружил нагрузки ДНК HBV в диапазоне от 5,1 × 109 до 5,1 × 102 МЕ / мл и РНК HCV в диапазоне от 4,9 × 109 до 4,9 × 102 МЕ / мл в сыворотке. Кроме того, анализ эффективно количественно определял оба вируса (r2 = 0,99) с адекватным LOD (1,9 × 102 МЕ / мл) для внутреннего qPCR. Чтобы продемонстрировать эффективность анализа qPCR, предложенного в этом исследовании, были испытаны клинические образцы пациентов, инфицированных HBV или HCV. Результаты показывают, что анализ может быть использован для количественной оценки как низких, так и высоких вирусных нагрузок и что его эффективность усиления стабильна в диапазоне номеров входных копий.

Важно отметить, что сравнение результатов этого анализа с данными из рекомендуемых в настоящее время клинических протоколов необходимо до того, как этот анализ может быть использован для долгосрочного мониторинга лечения ВГВ и ВГС. В заключение, в этом исследовании мы разработали новый анализ qPCR, основанный на системе Mq TaqMan, который является быстрым, чувствительным и точным. Этот анализ, подтвержденный как международными стандартами, так и клиническими образцами, обеспечивает идеальную систему для рутинной диагностики, для подтверждения неопределенных серологических результатов, особенно у пациентов с ослабленным иммунитетом, и для выявления виремии до сероконверсии.

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Это исследование было поддержано грантами Национального совета по научно-техническому развитию (CNPq) и Фонда научно-исследовательской поддержки штата Минас-Жерайс (FAPEMIG).

Электрофорез в геле (6% полиакриламид) продуктов, амплифицированных из генов кодирования HBV и HCV с помощью обычной ПЦР. MW, стандарт молекулярной массы (50 б.п.).

График амплификации и стандартная кривая HBV (соответственно A и B) и HCV (C и D соответственно), полученные с использованием Международной группы количественного определения HBV / HCV (AcroMetrix, Benicia, CA, USA) для проверки анализа qPCR. Результаты выражены в международных единицах / мл (МЕ / мл).

Графики амплификации и стандартные кривые, полученные с использованием стандартных плазмид для количественного определения вирусных нагрузок HBV (A и B соответственно) и HCV (C и D, соответственно). Ряд разбавления стандартных плазмид ДНК HBV и РНК HCV начинался с 5,1 × 109 МЕ / мл и 4,9 × 109 МЕ / мл для HBV и HCV, соответственно. Результаты выражены в МЕ / мл.

Праймеры и зонды, используемые в этом исследовании.

Результаты (значения Ct и наклон) от реакций qPCR с использованием различных концентраций наборов праймеров-зондов, нацеленных на консервативные гены HBV и HCV.



Источник: rupubmed.com

Читайте также
Вид:

Добавить комментарий