Гепатит в f1 f2

Гепатит в f1 f2

Hepatitis B virus genotypes circulating in Brazil: molecular characterization of genotype F isolates
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2231365/

Это статья открытого доступа, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License (), которая допускает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинальная работа была правильно указана.

Изоляты вируса гепатита B (HBV) были классифицированы по восьми генотипам от A до H, которые проявляют различные географические распределения. Генотипы A, D и F преобладают в Бразилии, стране, образованной miscegenated населением, где доля людей из кавказских, американских и африканских происхождения варьируется в зависимости от региона. Генотип F, который является наиболее расходящимся, считается коренным в Северной и Южной Америке. Систематическая молекулярная характеристика изолятов HBV из разных частей мира была бы неоценима при установлении эволюционных истоков и дисперсий HBV. Необходимо провести крупномасштабное исследование, чтобы отобразить распределение генотипов HBV по регионам в разных регионах Бразилии.

Генотипирование с помощью ПЦР-RFLP из 303 HBV-изолятов из HBsAg-положительных доноров крови показало, что по крайней мере два из трех генотипов A, D и F совместно циркулируют в каждом из пяти географических регионов Бразилии. Никаких других генотипов не было идентифицировано. В целом генотип А был наиболее распространенным (48,5%), и большинство из этих изолятов были классифицированы как субгенотип А1 (138/153, 90,2%). Генотип D был наиболее распространенным генотипом на юге (84,2%) и Центральном (47,6%) регионах. Распространенность генотипа F была низкой (13%) по всей стране. Нуклеотидное секвенирование гена S и филогенетический анализ 32 изолятов генотипа HBV показали, что подавляющее большинство (28/32; 87,5%) относится к субгенотипу F2, кластер II. Выведенный серотип 31 из 32 F изолятов был adw4. Оставшийся изолят показал замещение лейцина-изолейцина в положении 127.

Наличие генотипов A, D и F и отсутствие других генотипов в большой когорте инфицированных HBV индивидуумов могут отражать этническое происхождение бразильского населения. Высокая распространенность изолятов из субгенотипа A1 (африканского происхождения) указывает на то, что африканский приток в период колониального рабства оказал большое влияние на циркуляцию генотипа HBV A, который в настоящее время находится в Бразилии. Хотя большинство изолятов генотипа F относятся к кластеру II, наличие некоторых изолятов, принадлежащих к кластерам I (подгруппа Ib) и IV, указывает на существование двух или более вирусных популяций основателя генотипа F в Бразилии.

Вирус гепатита B (HBV) является прототипом семейства Hepadnaviridae, характеризующегося вирусами ДНК с тропизмом в печеночные клетки. HBV является этиологическим агентом заболеваний печени человека, включая острый и хронический гепатит, цирроз и гепатоцеллюлярную карциному. Таким образом, это представляет собой значительную проблему общественного здравоохранения, которая, по оценкам, хронически заражает более 350 миллионов человек во всем мире (см. [1]).

Геном HBV представляет собой частично двухцепочечную циркулярную молекулу ДНК длиной приблизительно 3,2 кб. Вирусные белки кодируются четырьмя частично перекрывающимися открытыми рамками считывания (ORF), которые позволяют вирусу вырабатывать на 50% больше белков, чем прогнозировалось бы с помощью небольшого размера генома. HBV также имеют необычную стратегию репликации. Поскольку они сначала синтезируют интермедиаты РНК, из которых синтезируется ДНК с помощью обратной транскрипции, вирусы ДНК HBV имеют скорости замещения более чем в 10 раз выше, чем другие ДНК-вирусы.

На основании генетических различий HBV были разделены на восемь геномных групп (A-H). Целые последовательности геномов в каждой группе отличаются от других групп более чем на 8%. Эти восемь групп имеют различные географические распределения [2,3]. Генотип А распространен в глобальном масштабе и является основным генотипом в Европе, Северной Америке, Африке и Индии. Генотипы B и C преобладают в Восточной и Юго-Восточной Азии и Австралии. Генотип D в основном встречается в странах Ближнего Востока и Средиземноморья, но сообщается в глобальном масштабе, тогда как генотип E, по-видимому, преобладает в Западной Африке. Генотип G был охарактеризован в образцах из США, Мексики и Франции, а генотипы F и H встречаются исключительно в Центральной и Южной Америке (см. [4,5]).

Некоторые генотипы далее подразделяются на подгруппы (субгенотипы) с различным географическим происхождением. В настоящее время штамм генотипа HBV A делится на три генетических кластера. Субгенотип A1 представляет собой изоляты с афро-азиатским происхождением, тогда как субгенотип A2 включает изоляты с европейским и североамериканским происхождением [6]. Недавно в Камеруне был описан новый субгенотип, обозначенный как A3 [7]. Генотипы B [3,8-10] и C [3,11,12] были разделены на четыре субгенотипа, а генотип D [3,13,14] был разделен на пять субгенотипов. Генотип F, который представляет собой наиболее расходящуюся группу [15], является коренным для Северной и Южной Америки и является основным циркулирующим генотипом в Аргентине [16-18], Венесуэле [19,20], Перуанском бассейне Амазонки [21], Северной Бразилии [ 22] и стран Центральной Америки, включая Коста-Рику, Сальвадор и Никарагуа [23]. В последнее время для этого генотипа были предложены два субгенотипа F1 и F2, каждый из которых характеризуется специфическим аминокислотным остатком Leu45 и Thr45 соответственно в малом (S) продукте гена [24]. Разделение изолятов из генотипа F на пять кластеров (Ia, Ib, II, III и IV) также было предложено Mbayed et al. на основе сравнений между последовательностями гена S [25]. Кластеры Ia и Ib, связанные с субгенотипом F1, представляют собой штаммы, обнаруженные, главным образом, в Центральной Америке и Аргентине, соответственно. Субгенотип F2 включает кластеры II (Никарагуа, Венесуэла и Бразилия), III (Панама, Венесуэла и Колумбия) и IV (Аргентина и Боливия) (см. [4]).

Бразилия является федерацией из 26 штатов и одним федеральным округом, занимающим приблизительно 8 500 000 км2, разделенным в широком смысле на пять географических регионов: Северный, Северо-Восточный, Центрально-Западный, Юго-Восточный и Южный. Ранние исследования показали изменчивость распространенности HBV в разных бразильских регионах. Бассейн Амазонки, соответствующий Северному региону и северным частям Центрально-Западного региона, характеризуется скоростью эндемичной инфекции ВГВ, в отличие от низкой распространенности, обнаруженной в южных районах страны [22,26-28] , Бразилия, страна с крайне ошибочным населением, демонстрирует характер циркуляции генотипа HBV, который отличается от распределения, обнаруженного в других странах Латинской Америки, причем генотипы A, D и F являются наиболее распространенными среди носителей HBV [29-31].

В этом исследовании мы провели молекулярную характеристику штаммов HBV, полученных от доноров HBsAg-положительных доноров, живущих в разных бразильских регионах. S, а также филогенетический анализ были проведены для определения взаимосвязи между изолятами генотипа HBV F из Бразилии и других американских стран.

Генотипирование ПЦР-RFLP из 303 HBV-изолятов из всех пяти бразильских географических регионов показало, что генотипы A, D и F присутствуют на разных частотах; в проанализированных образцах не было выявлено никаких других генотипов. Генотип А был наиболее распространенным на севере (52/82, 63,4%), северо-восточном (13/24, 54,2%) и юго-восточном (36/56, 64,3%) регионах. Генотип D был наиболее распространенным на Юге (32/38, 84,2%), тогда как изоляты генотипа F отсутствовали в этом регионе (рис. 1). В центре страны, представленном Центрально-Западным регионом, наблюдалось сбалансированное распределение генотипов A (46/103, 44,7%) и D (49/103, 47,6%). По всей стране генотип А был наиболее распространенным (48,5%), за ним следуют генотип D (38,5%) и генотип F (13%).

Распределение генотипов HBV в разных бразильских регионах. Карта, представляющая генотипическое распределение HBV во всех пяти регионах Бразилии (1 — Северный регион, 2 — Северо-восточный регион, 3 — Центрально-Западный регион, 4 — Юго-восточный регион, 5 — Южный регион).

Как показано в предыдущей работе [31], метод генотипирования ПЦР-RFLP разделял каждый генотип на разные образцы RFLP. В текущем исследовании было обнаружено в общей сложности тринадцать образцов RFLP (таблица 1). Изоляты генотипа А были разделены на четыре модели: AI-AIV, подавляющее большинство из которых были классифицированы как AI или AII (138/153; 90,2%). Среди пяти образцов RFLP, обнаруженных для генотипа D (DI-DV), наиболее распространенными были образцы DI и DII (92/116; 79,3%). Для генотипа F наиболее часто встречалась модель (20/34; 58,8%) из четырех найденных моделей (FI-FIII, FV).

Распределение образцов RFLP в HBV-изолятах HBsAg-положительных доноров крови, живущих в разных бразильских географических регионах.

Результаты анализа ПЦР-FRLP были подтверждены прямым нуклеотидным секвенированием продуктов ПЦР гена HBV S из 62 из 303 образцов (20,5%), включая случайно выбранные образцы из генотипа A (22 образца) и генотип D (13 образцов) и 27 образцы из генотипа F. Никаких расхождений между этими двумя методами не обнаружено. Среди образцов генотипа А 15/22 (68,2%) были классифицированы как субгенотип А1 и 7/22 (31,8%) в качестве субгенотипа А2. Филогенетический анализ образцов генотипа D назначал 10/13 (76,9%) субгенотиту D3 и 3/13 (23,1%) до субгенотипа D2. Выведенная аминокислотная последовательность продукта S-гена и анализ антигенной детерминанты остатков 122 и 127 подтвердили ожидаемую картину серотипа всех, кроме одного генотипированного образца. Все 22 образца генотипа HBV были классифицированы как серотип adw2. Девять образцов генотипа D были классифицированы как серотипы ayw2, а три были идентифицированы как ayw3. Из 32 образцов F генотипа HBV 31 были adw4, а один из 052-N имел необычную замену изолейцина на лейцин у остатка 127. Три изолята генотипа А HBV (358-S; 312-SE; 161-CW) были показано, что он содержит тирозин и цистеин в детерминанте остатка 100 (Y100C), а двойной мутант T118V-A128V был обнаружен в трех изолятах генотипа D (таблица 2). Частичная аминокислотная последовательность полимеразы HBV показала аминокислотные замены, связанные с фенотипом резистентности к ламивудину, в двух изолятах, полученных из этой группы положительных доноров крови HBsAg. Один (209-CW) показал двойную мутацию резистентности к ламивудину rtL180M-rtM204V, а другой (043-N) показал дополнительную мутацию rtV173L, что также связано с резистентностью к ламивудину [32] (таблица 2).

S замены аминокислот и устойчивых к ламивудину rt доменных мутаций, обнаруженных у доноров крови.

* Выведенная аминокислотная последовательность полимеразы HBV на основе сдвинутой рамки считывания секвенированного гена S (ген P: aa rt 9-236).

Филогенетический анализ последовательностей генов S из 32 изолятов F генотипа HBV (27 из доноров крови и 5 ранее охарактеризованных образцов сыворотки из родного племени америнских апуринов) в наборе с 27 международными последовательностями генотипа HBV (GenBank), классифицированными изолятами генотипа F в пять различных подгрупп (рис. 2). Используя топологию филогенетического дерева, мы смогли идентифицировать субгенотипы F1 и F2 (рис. 2). Подавляющее большинство бразильских генотипов F, определенных в настоящем исследовании (28/32, 93,75%), были классифицированы как субгенотип F2, тогда как только два образца (2/32, 6,25%) были сгруппированы в субгенотип F1. Анализ аминокислот подтвердил этот вывод, показывая, что все образцы, сгруппированные по субгенотипу F2 филогенетическим анализом, содержали треонин в положении 45 продукта S-гена, тогда как два субгенотипических образца F1 имели лейцин в этой позиции (данные не показаны) , Топология дерева также позволила идентифицировать пять кластеров генотипа F (рис. 2). Двадцать восемь из 32 проанализированных образцов (87,5%) были классифицированы в кластер II, а 2 группы (6,25%) были отнесены к кластеру IV; два субгенного образца F1 были связаны с кластером Ib. Коррелируя образцы RFLP и филогенетические кластеры изолятов, принадлежащих к генотипу F для всех бразильских образцов, мы обнаружили, что образцы, которые характеризуются как RFL-образец FI, были сгруппированы в кластер II, тогда как те, которые классифицированы как FII и FIII на основе образцов RFLP, были связаны с изоляты из кластера IV и Ib соответственно.

Филогенетическое дерево, представляющее изоляты H генотипа HBV. Бразильские последовательности, определенные в этом исследовании, представлены жирным шрифтом (•), обозначенным соответствующей областью выборки (N: Северный регион, северо-восточный регион: CW: Центрально-Западный регион, юго-восточный регион) с рисунком RFLP в скобках , Международные последовательности обозначаются их номером присоединения, за которым следуют их страны происхождения.

Ранее описанная совместная циркуляция генотипов HBV A, D и F в Бразилии [31,33-39] была подтверждена в настоящем исследовании, что также показало, что в образце из 303 доноров крови не было других генотипов HBV. Идентификация образцов распространенности генотипа в Бразилии, которые отличаются от моделей географического распределения по всему миру, может быть отражением сильно мигрирующего и крайне ошибочного характера бразильского населения. Генотипы В и С, ранее идентифицированные у нескольких бразильских индивидуумов, всех азиатских происхождения [36,40], не были обнаружены в настоящем исследовании. Отсутствие генотипов В и С может объясняться сочетанием ограниченного размера выборки и несбалансированного распределения лиц из азиатского происхождения на всей территории Бразилии (что отражает тенденцию азиатских иммигрантов концентрироваться в определенных географических районах).

Распределение генотипов HBV A и D в Бразилии, по-видимому, следовало за градиентом от северных до южных регионов (рис. 1). Северный, Северо-Восточный и Юго-Восточный регионы показали более высокую распространенность генотипа А, самого распространенного генотипа в Бразилии. Высокий уровень изолятов генотипа D в Южном регионе может быть связан с притоком иммигрантов из Центральной Европы (особенно из Германии и Италии), которые произошли в этом регионе в начале 20-го века. Сбалансированное распределение генотипов A и D в регионе Среднего Запада можно объяснить задержкой оккупации этой области потоками миграции населения из регионов Юга, Юго-Восточного и Северо-Восточного регионов.

Первоначально генотип HBV был разделен на две генетические подгруппы A1 и A2 на основе расходимости последовательности [6,7]. Ранее описанный метод генотипирования ПЦР-RFLP классифицировал изоляты HBV более чем на 20 образцах [31]. Последовательности, показывающие шаблоны AI, AII и AVI, сгруппированные в подгруппе A1, тогда как те, которые показывают рисунки AIII и AV, были найдены исключительно в подгруппе A2. В настоящем исследовании RFLP и анализ последовательностей изолятов генотипа А, циркулирующих в Бразилии, показали высокую распространенность изолятов из подгруппы A1 (90,2%, таблица 1), подтверждающие предыдущие результаты и свидетельствующие о том, что генотип HBV A, циркулирующий в Латинской Америке, не является исключительно связанный с европейским притоком, как когда-то считалось (рассмотрено в [4]). Напротив, массовая африканская вынужденная миграция в колониальные времена (с 16-го по 19-й век) была основным фактором распространения циркуляции HBV, который в настоящее время находится в Бразилии. Отсутствие генотипа E, циркулирующего в Африке к югу от Сахары, где происходило существенное движение рабов, можно объяснить относительно недавним появлением этого генотипа как человеческого патогена, начиная с середины и до конца 19 века [41], когда работорговля уже были отменены.

Крупномасштабное исследование по географическому распределению подтипов HBsAg в Бразилии, опубликованное в конце 1980-х годов, показало высокую распространенность adw2 (связанного с генотипом A) во всех регионах, за исключением Южного региона, где подтипы ayw2 и ayw3 (оба ассоциированные с генотипом D) были наиболее распространенными [22]. Эти результаты согласуются с нашими текущими результатами. Тем не менее, другие результаты этого предыдущего исследования, в том числе сообщенное отсутствие подтипов, отличных от adw2 в северо-восточном регионе, подавляющее большинство подтипов adw2 в регионе Центрально-Западного региона и высокая распространенность подтипа adw4 (генотип F) на Севере региона, не подтверждены нашим исследованием. Эти расхождения могут быть объяснены различиями в методологии: поскольку в первом исследовании были классифицированы изоляты HBV на основе различий в антигенных детерминантах [22], которые обычно требуют высоких титров HBsAg для определения подтипа, он может иметь неправильные показатели низкого титра, которые легко классифицированных с использованием генотипических анализов. В качестве альтернативы могут возникать разные выводы из-за различий в выборке, которые влияют на исследуемую популяцию и приводят к смещению распространенности генотипа с недооценкой генотипа F. Например, в текущем исследовании анализировались образцы сыворотки из банков крови, расположенных в столицах штатов Бразилии, стратегия выборочного контроля, которая, как правило, недопредставила определенные группы, такие как индейцы, которые не часто являются добровольными донорами крови. Также возможно, что данный генотип вызывает более симптоматическую инфекцию, что приводит к снижению ее распространенности в потенциальной популяции доноров крови. Для решения этого вопроса потребуются дальнейшие исследования, сравнивающие клинические исходы у пациентов, инфицированных генотипами A, D и F.

В целом, генотип HBV F, который является родным для индейцев, показал низкую распространенность в Бразилии (13%). Это справедливо даже в Северном регионе, где коренное население индейцев составляет большую часть всего населения. Этот результат подтверждает результаты Moraes et al. [33] и контрастирует с высокой распространенностью генотипа F, описанной в других южноамериканских странах, включая Венесуэлу [19,20] и Аргентину [16,18]. Эти данные показывают, что в Бразилии коренное население индейцев внес незначительный вклад в популяцию в целом, что подтверждается анализом ДНК митохондрий [42, 43].

В качестве отправной точки для установления молекулярной характеристики бразильских изолятов генотипа HBV F мы определили последовательности гена S. В сочетании с филогенетическим анализом нуклеотидные последовательности отдельных генов, в частности гена S, могут выявлять связи, которые помогают выявить молекулярную эпидемиологию HBV [4, 25, 44, 45]. Топология филогенетического дерева генотипа HBV F показала, что подавляющее большинство бразильских штаммов, охарактеризованных в настоящем исследовании, можно классифицировать как субгенотип F2, кластер II. В двух предыдущих исследованиях описана одна бразильская последовательность, принадлежащая кластеру II [17,25]. В настоящем исследовании были обнаружены изоляты генотипа HBV F с последовательностями, тесно связанными с группами, сгруппированными в кластерах IV и Ib, что указывает на то, что бразильские штаммы генотипа F могут не происходить друг от друга. Предполагая, что пять образцов, ранее охарактеризованных как генотип F из племени Апуринья (apurina_01-05), представляют собой родной исходный HBV бразильских индейцев и далее предполагают, что подавляющее большинство бразильских последовательностей генотипа F, определенных в этом исследовании, были тесно связаны с ними , разумно сделать вывод о том, что генотип HBV F, циркулирующий в Бразилии, в основном получен из коренных аборигенных популяций. Однако различия, наблюдаемые между двумя последовательностями, сгруппированными в кластер Ib (232-NE; 221-NE) и другие последовательности генотипа F, могут указывать на то, что в Бразилии циркулируют две или три вирусные популяции с различным происхождением. Более того, существование этого четко определенного кластера как представителя бразильского изолята указывает на то, что генотип HBV F возник из общего предка, но развивается отдельно после того, как он изолируется в разных регионах Америки.

Генотипирование с использованием анализа ПЦР-RFLP и секвенирование нуклеотидов дало тот же результат для всех 62 испытуемых образцов, что указывает на то, что наш генотипический метод ПЦР-RFLP подходит для крупномасштабных исследований. Как и в нашем предыдущем докладе об изолятах генотипа А [31], наши результаты здесь показывают интересную корреляцию между идентифицированными образцами RFLP и кластерным анализом изолятов генотипа HBV F. Было обнаружено, что все изоляты FI RFLP-структуры, подвергнутые нуклеотидному секвенированию, группируются в кластер II генотипа F, тогда как два изолята, сгруппированные в кластере IV (326-SE; 179-CW) и два изолята, сгруппированные в кластере Ib (232-NE; 221-NE) были классифицированы как RFL-образец FII и FIII, соответственно. Хотя для подтверждения этой связи потребуется более обширная выборка, возможно, что образцы RFLP могут быть использованы для определения того, к какому кластеру относится изолят генотипа HBV F.

Идентификация нового замещения изолейцина в остатке 127 в одном изоляте F генотипа HBV (052-N), классифицированном серотипом с использованием аминокислотного анализа, подтверждает необходимость дальнейшего изучения штаммов генотипа F. Выведенная аминокислотная последовательность продукта S-гена также выявила три изолята с детерминантой замещения Y100C, которая связана с HBsAg-отрицательным / анти-HBc-положительным фенотипом у доноров крови из Венесуэлы [46] и была обнаружена в HBsAg-положительный бразильский пациент [47]. Дальнейшие исследования потребуются для определения того, действительно ли эта мутация связана с уменьшением обнаружения HBsAg. Двойная мутация T118V-A128V была обнаружена в трех генотипических D / ayw3 (субгенотипических D2) изолятах. Эти замены, которые были найдены в других субгенотипических изолятах D2 [3], недавно были идентифицированы в Бразилии (неопубликованные данные), Испании, Швеции и Польши [48].

Выведенная аминокислотная последовательность полимеразы HBV показала, что два изолята имели замены в остатках, связанных с устойчивостью к ламивудину. Частая резистентность к ламивудину rtL180M-rtM204V была обнаружена в двух изолятах (043-N и 209-CW), а третий изолят (043-N) показал редкую тройную мутацию rtV173L-rtL180M-rtM204V (таблица 2). Известно, что этот тройной мутант проявляет сниженную аффинность in vitro к антителам против HBs, подобным мутанту G145R для выведения вакцины против гепатита B [32,49]. Эти результаты были неожиданными, поскольку образцы, проанализированные в настоящем исследовании, были получены от доноров крови, группы лиц, не получавших терапию ламивудином. Тем не менее, резистентные к ламивудину изоляты в конечном итоге должны циркулировать в окружающей среде в результате контакта с пациентами с хроническим гепатитом В, проходящим ламивудиновую противовирусную терапию, позволяя здоровым людям, включая доноров крови, подвергаться первичной инфекции с мутантным штаммом HBV , Наличие резистентных к ламивудину изолятов также может быть связано с ранее сообщениями о изолятах HBV с мутацией мотива YMDD у пациентов с хроническим гепатитом B, не получавших ламивудин [50,51].

Эволюционное происхождение HBV остается неопределенным. Хотя некоторые ранние исследования предполагали появление нового мира для этого вируса, данные неоднозначны, и конкретные выводы следует делать с осторожностью [52,53]. Диверсификация генотипов HBV плохо изучена, но оценки, основанные на показателях филогенетической дивергенции, подсчитали, что генотипы HBV расходятся менее чем 6000 лет назад (обзор в [54]). Происхождение генотипа F особенно неясно и может представлять собой первый раскол от предка человека-гепаднавирального предка (рассмотрен в [12]). Как отмечают многие авторы, уточненный анализ эволюционной истории HBV потребует более обширной выборки геномов HBV.

Распределение генотипов HBV A и D, определенных в настоящем исследовании, сопровождалось явным градиентом от северных до южных районов Бразилии, возможно, отражая влияние ранних популяций и моделей поселений в процессе оккупации страны. Высокая распространенность изолятов из подгруппы А1 (90,2%) может означать важный вклад принудительного притока Африки в период колониального рабства в нынешнюю циркуляцию генотипа А в Бразилии.

В отличие от других латиноамериканских стран, генотип HBV F показал низкую распространенность в Бразилии (13%), даже в Северном регионе, где коренное население аборигенов оказывает большее влияние. Топология филогенетического дерева для штаммов генотипа HBV F позволила классифицировать большинство штаммов в субгенотипе F2 в кластере II. Наличие этого четко определенного кластера как представителя бразильского изолята указывает на то, что генотип HBV F возник из общего предка, но развивается отдельно после того, как он изолируется в разных регионах Америки. Наличие некоторых изолятов кластеров IV и I (подгруппа Ib) доказывает существование двух или более вирусных популяций генотипа F в Бразилии. Поскольку диверсификация генотипов HBV остается плохо понятой, особенно в отношении генотипа F, более обширная выборка геномов HBV была бы полезной для раскрытия сложной эволюционной истории HBV.

В период с 2003 по 2004 год в банках крови, расположенных в столицах штатов Бразилии, представляющих разные бразильские регионы, было собрано 303 образца сыворотки от доноров HBsAg-положительных доноров крови. Тридцать восемь образцов были из штата Санта-Катарина (Южный регион); 56 образцов были из штата Рио-де-Жанейро (юго-восточный регион); 103 образца были из трех штатов, которые составляют центрально-западный регион: Гойас (18), Мату Гроссо (55) и Мату Гросу до Сул (30); 24 образца были из штата Пернамбуко (Северо-Восточный регион); и 82 образца были из Северного региона (35 из Пара, 34 из Амазоны и 13 из Амапы). Кроме того, в исследование были включены пять образцов HBsAg-положительной сыворотки из коренного американского индейца Апурина (Amazonas, Бразилия), ранее описанного как генотип F с помощью ПЦР-RFLP.

ДНК HBV представляла собой фенол / хлороформ, экстрагированный из 250 мкл сыворотки после обработки 0,5 мг / мл протеиназы К в течение 4 ч при 37 ° С в присутствии 0,2 М NaCl и 0,25% SDS, как описано ранее [55]. После осаждения этанолом осадок высушивали и ресуспендировали в 30 мкл дистиллированной воды. Область генома до S / S амплифицировали с помощью полуположенной ПЦР. Первый раунд содержал один смысловой праймер (C1, 5′-CTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGC-3 ‘, nt позиции 1935-1958) и два антисмысловых праймера (S2, 5′-GGGTTTAAATGTATACCCAAAGA-3′, 819-841 и S22, 5’-GTATTTAAATGGATACCCACAA -3 ‘, 819-841), расположенных в одном и том же положении на геноме для облегчения амплификации всех генотипов HBV [33]. После начальной стадии денатурации (3 мин при 94 ° С) ДНК амплифицировали, используя 35 циклов 94 ° С в течение 40 с, 55 ° С в течение 1 мин и 72 ° С в течение 2 мин 30 с с последующим окончательным удлинением (7 мин при 72 ° С). Первый раунд амплификации проводили с 1 мкл ДНК и одной единицей ДНК-полимеразы Taq (Invitrogen, San Diego, CA) в конечном объеме 25 мкл. Второй раунд амплификации проводили в конечном объеме 50 мкл, используя 1 мкл продукта ПЦР первого раунда, смысловой праймер PS1 (5’-CCATATTCTTGGGAACAAGA-3 ‘, 2826-2845) и антисмысловые праймеры S2 и S22 под следующие условия: 30 циклов 95 ° С в течение 30 с, 52 ° С в течение 40 с и 72 ° С в течение 2 мин с последующей стадией окончательного удлинения (7 мин при 72 ° С). Десять микролитров продукта амплификации (длиной около 1200 п.о.) загружали на 1% агарозные гели, подвергали электрофорезу, окрашивали бромидом этидия и визуализировали под ультрафиолетовым светом. Генотипирование по RFLP-анализу выполняли, как описано ранее [31], используя 10 мкл продуктов ПЦР, расщепляемых отдельно с двумя единицами рестрикционных эндонуклеаз BamHI, EcoRI и StuI (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) при 37 ° C в течение 2 часов. Продукты пищеварения анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле.

Ген HBV S из 62 генотипированных образцов RFLP был секвенирован для проверки точности метода генотипирования на основе RFLP. Двадцать два образца, которые были идентифицированы как генотип А и 13 образцов в качестве генотипа D методом на основе RFLP, были случайным образом выбраны для нуклеотидного секвенирования. Двадцать семь образцов, которые были определены как генотип F и 5 образцов из родного племени америндов Apurinã (Amazonas, Brazil), ранее описанных как генотип F, также были секвенированы. S-ген сначала амплифицировали с помощью ПЦР с использованием смеси одного смыслового праймера (S1, 5′-CTTCTCGAGGACTGGGGACC-3 ‘, nt позиций 124-143) и двух антисмысловых праймеров (S2, S22, описанных выше) с последующей очисткой продуктов ПЦР с использованием набора для экстракции гель QIAquick (QIAGEN, Валенсия, Калифорния). Очищенные продукты ПЦР были подготовлены для секвенирования с использованием набора для кратковременных циклов Big Dye Terminator 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) с внешними праймерами S1 и S2 или S22, внутренний смысловой праймер S4 (5’-TGCTGCTATGCCTCATCTTCT-3 ‘, nt 416- 436) и антисмысловой S7 (5’-TGAGCCAGGAGAAACGGGCT-3 ‘, nt 676-656). Последовательность была определена путем разделения и анализа продуктов расширения с использованием автоматизированного анализатора ДНК ABI 3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Данные последовательности генных HBV S-генов обрабатывались с использованием программ из пакета генетической компьютерной группы (GCG) (University of Wisconsin, Madison, WI). Филогенетический анализ проводили путем сравнения 681 bp последовательностей из гена HBV S, определенного в этом исследовании, с последовательностями HBV, доступными в GenBank. Последовательности были выровнены с использованием программы Clustal W [56], а анализ филогенетического дерева был выполнен с использованием метода соседнего соединения (тест рестайлинга бутстрапа с 1000 репликами) в программном обеспечении MEGA версии 3.0 [57]. Все последовательности, определенные в этом исследовании, были депонированы в базе данных GenBank [GenBank: EF690470 — EF690536].

FCAM провела эксперименты по молекулярной биологии и написала рукопись. FJDS, LCN, CAVN, HSMC, HCFF, JCPS, HAV, ARCMC, MMMM и RMBM отвечали за оценку HBsAg и эпидемиологические данные положительных доноров крови HBsAg. САГ задумал исследование, принял участие в его разработке и координации и исправил окончательный вариант рукописи. Все авторы прочитали и утвердили окончательную рукопись.

Авторы выражают благодарность д-ру Кристиану Нилю за его ценные замечания и за пересмотр рукописи, а также за Plateforma Genômica — Seqüenciamento de DNA / PDTIS-FIOCRUZ за выполнение последовательности ДНК.



Источник: rupubmed.com


Добавить комментарий